Marco Bezzecchi mendominasi sesi latihan bebas kedua di Misano dengan menggunakan ban belakang lunak baru dan mencatat waktu tercepat 1:30.624. Pembalap Aprilia ini berhasil mengungguli Franco Morbidelli dan Luca Marini, keduanya juga merupakan anggota VR46 Riders Academy. Sementara itu, Pedro Acosta finis di posisi keempat diikuti oleh Marc Marquez, Alex Marquez, dan Fabio Quartararo. Trio Ducati, Pecco Bagnaia, Fabio Di Giannantonio, dan Fermín Aldeguer, berada di 10 besar namun tidak mampu mengungguli Quartararo.
Jorge Martin dan Jack Miller mengalami kecelakaan ringan saat sesi latihan. Martin terjatuh di Tikungan 1 tanpa cedera serius, sementara Miller harus menyelam ke run-off untuk menghindari benturan dengan dinding. Sedangkan Joan Mir, yang menderita kecelakaan parah pada hari sebelumnya, memutuskan untuk istirahat pada hari Sabtu. Mir mengalami nyeri dan kompresi pada lehernya setelah insiden tersebut, sehingga tidak bisa mengikuti sesi kualifikasi dan balapan sprint. Pembalap Honda Racing ini berharap untuk kembali dalam performa terbaiknya pada balapan Minggu setelah istirahat dan pemulihan yang cukup.
